ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪助力感觉神经在皮肤屏障修复中的作用研究

2024年3月京都大学医学院的中嶋千紗团队在《Journal of Allergy and Clinical Immunology》（IF:14.2）上发表了题为“TRPV1-positive sensory nerves and neuropeptides are involved in epidermal barrier repair after tape stripping in mice"的研究文献。研究以小鼠为实验模型，探究了感觉神经在胶带剥离诱导的表皮损伤后皮肤屏障修复中的具体作用，明确了TRPV1阳性感觉神经及相关神经肽在这一过程中的调控机制，同时揭示了生长抑素对白细胞介素6（IL-6）诱导的角质形成细胞分化下调的保护作用。

摘要

皮肤的表皮系统是一道重要的保护屏障，角质层处于这道屏障的最外层，由能生物合成丝聚蛋白的角质形成细胞构成，丝聚蛋白是维持皮肤健康的关键成分。然而，与伤口愈合过程不同，感觉神经在胶带剥离诱导的表皮损伤后皮肤屏障修复中的具体作用，至今仍是一个未解之谜。

本研究旨在阐明感觉神经在胶带剥离诱导的表皮损伤后表皮屏障修复中的潜在作用。研究人员通过构建树脂毒素（RTX）处理的去神经小鼠模型，探究了胶带剥离后小鼠皮肤屏障修复的动力学特征，并对小鼠皮肤或背根神经节进行免疫表型分析和基因表达分析，以筛选潜在的相关神经肽；同时评估了候选神经肽对小鼠角质形成细胞及RTX处理小鼠皮肤屏障恢复的功能影响。

结果显示，消融TRPV1阳性感觉神经会减缓小鼠皮肤屏障的修复进程，并导致皮下炎症持续存在，同时胶带剥离后小鼠耳组织匀浆中的IL-6水平明显升高；与对照组小鼠相比，RTX处理的小鼠耳皮肤中角质形成细胞分化标志物Flg的表达降低。经神经肽筛选发现，生长抑素或奥曲肽可逆转IL-6介导的Flg表达下调；此外，给予奥曲肽的RTX处理小鼠，其胶带剥离后的皮肤屏障修复得到部分改善。

研究结论为，表达TRPV1的感觉神经元在表皮损伤后的屏障功能恢复中发挥着重要的作用，本研究结果提示生长抑素可能参与了皮肤损伤后的表皮修复过程。

实验材料与仪器列举

实验动物

4-12周龄雌性C57BL/6J小鼠、6-19周龄雌雄不限的Nav1.8-Cre R26-CAG-LoxP-EGFP-TeNT小鼠；Nav1.8-Cre小鼠、R26 CAG-LF-EGFP-TeNT小鼠、ACTB-FLPe小鼠。

实验试剂

辣椒素、树脂毒素、奥曲肽醋酸盐、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、甘丙肽、生长抑素、dispase II、0.05%胰蛋白酶-EDTA、角质形成细胞生长培养基2、溴脱氧尿苷、白细胞介素6、1.3 mM氯化钙、TRIzol试剂、RNeasy Mini试剂盒、Prime Script RT反转录试剂盒、SYBR Green I Master、Bio-Plex细胞裂解试剂盒、Micro BCA蛋白测定试剂盒。

实验仪器

ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪、pH计、LightCycler 480 Instrument II荧光定量PCR仪、FastPrep-24组织匀浆系统、Bio-Plex细胞因子检测平台、增殖酶联免疫吸附测定试剂盒检测相关设备、胶原包被的96孔板、24孔板、超低温冰箱。

ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪

实验过程

本研究整体围绕动物模型构建、皮肤屏障损伤造模、分子检测、细胞实验四大核心环节展开，具体实验步骤如下：

1. TRPV1阳性感觉神经去神经小鼠模型构建：对小鼠背部皮下注射梯度剂量的RTX（30、70、100 mg/kg），连续注射3天，对照组小鼠注射溶媒（含0.01%乙醇的PBS）；造模后让小鼠休息至少3周，通过辣椒素诱导的眼部擦拭实验验证去神经效果，若小鼠无伤害性擦拭行为，表明TRPV1阳性感觉神经消融成功。

2. 胶带剥离诱导小鼠皮肤表皮屏障损伤：使用Nichiban玻璃纸胶带对小鼠左耳腹侧进行连续胶带剥离，直至经皮水分流失（TEWL）值达到60.0~90.0 g/m²·h；对于奥曲肽治疗组，在胶带剥离后立即对RTX处理小鼠皮下注射奥曲肽（100 mg/kg，每日两次），持续5天，对照组注射PBS。

3. 皮肤屏障功能指标检测：在胶带剥离后的不同时间点，检测小鼠皮肤的TEWL值和皮肤表面pH，作为表皮屏障功能恢复的评价指标；同时在各时间点收集小鼠耳组织和背根神经节，速冻后用于后续分析。

4. 细胞实验：小鼠原代角质形成细胞的培养与检测

分离成年对照组和RTX处理小鼠的耳皮肤，经dispase II和胰蛋白酶-EDTA消化后，获得原代角质形成细胞，接种于胶原包被板，在KGM2培养基中培养，用于增殖和分化实验；同时分离出生24小时内新生小鼠的皮肤制备原代角质形成细胞，用于神经肽筛选实验。

增殖实验：将角质形成细胞接种于96孔板，培养48小时后加入溴脱氧尿苷继续培养24小时，通过ELISA试剂盒检测溴脱氧尿苷的掺入量，评估细胞增殖能力。

分化实验：将角质形成细胞用含1.3 mM CaCl₂的高钙培养基诱导分化，其中成年小鼠细胞分化3天，新生小鼠细胞分化5天；新生小鼠细胞分化的最后2天，在培养基中加入IL-6及不同神经肽（PACAP、甘丙肽、生长抑素、奥曲肽，浓度均为1mM），最终通过定量PCR检测角质形成细胞分化标志物Flg的mRNA表达。

5. 分子水平检测

定量RT-PCR分析：提取小鼠耳组织和背根神经节的总RNA，反转录为cDNA后，采用SYBR Green法进行定量PCR，检测炎症细胞因子、神经肽及受体、屏障相关基因的mRNA表达，以核糖体蛋白Rplp1为内参基因，通过2^(-ΔCt)法计算基因相对表达量。

细胞因子定量：将速冻的小鼠耳组织用含蛋白酶抑制剂的裂解液匀浆，经离心取上清，通过Bio-Plex平台检测IL-5、IL-6、IL-13的蛋白水平，并用Micro BCA试剂盒测定总蛋白含量对细胞因子水平进行归一化。

6. 统计学分析：所有实验数据以均值±标准差表示，使用Pharmaco Basic软件进行统计分析；经F检验检验方差齐性后，采用Student t检验或Welch检验比较两组差异；多组比较经Bartlett检验后，采用Dunnett检验或Steel检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结论

1. TRPV1阳性感觉神经的消融会减缓小鼠胶带剥离后的表皮屏障修复，表现为TEWL值和皮肤表面pH持续升高，同时伴随皮下炎症的持续存在，其中IL-6的表达上调，且角质形成细胞分化标志物Flg的mRNA表达降低；而Nav1.8-Cre R26-CAG-LoxP-EGFP-TeNT小鼠（C纤维和Aδ纤维感觉神经的胞吐被阻断）也出现TEWL值持续升高，表明表皮屏障修复受损是由感觉神经元功能障碍导致。

2. 胶带剥离后，对照组小鼠背根神经节中Adcyap1、Gal、Sst三种神经肽的mRNA表达上调，且高钙培养基诱导分化的小鼠角质形成细胞中，PACAP受体Vipr1、甘丙肽受体Galr2、生长抑素受体Sstr2的表达也上调，提示这些神经肽可能参与表皮损伤后的皮肤屏障修复。

3. IL-6会导致小鼠角质形成细胞中Flg的mRNA表达下调，而生长抑素或其类似物奥曲肽可逆转这一效应，PACAP和甘丙肽则无此作用；同时，奥曲肽可使RTX处理的去神经小鼠的TEWL值和皮肤表面pH得到部分改善，实现皮肤屏障修复的部分恢复。

4. 表达TRPV1的感觉神经元在表皮损伤后的皮肤屏障功能恢复中具有不可替代的作用，而由TRPV1阳性感觉神经释放的神经肽生长抑素，可通过拮抗IL-6诱导的角质形成细胞分化下调，参与皮肤损伤后的表皮修复过程。