VAPOSCAN经皮水分流失测量仪助力AhR激动剂在特应性皮炎小鼠模型作用研究

2024年7月，日本烟草公司制药研究所的Toshiki Urashima研究团队在《BPB Reports》上发表了一篇题为“Tapinarof, a Novel Topical Therapeutic Aryl Hydrocarbon Receptor Agonist, Suppresses Atopic Dermatitis-like Skin Inflammation in Mice"的研究文献。该研究探究了新型外用芳香烃受体激动剂Tapinarof的药理学特性，以及其在2,4-二硝基氟苯诱导的特应性皮炎样皮肤炎症小鼠模型中的治疗效果。

摘要

本维莫德是一种非甾体类小分子芳香烃受体激动剂，目前正被研发用于治疗特应性皮炎。特应性皮炎是一种由2型辅助性T（Th2）细胞介导的慢性炎症性皮肤病，其特征为表皮分化障碍和皮肤屏障功能受损。已有研究表明，Tapinarof可通过激活AhR调控靶基因表达，改善皮肤屏障功能并发挥抗氧化作用。本研究探究了Tapinarof的药理学特性，以及其在DNFB诱导的AD样皮肤炎症小鼠中的疗效。在经T细胞激活剂刺激的人外周血单个核细胞中，Tapinarof可诱导AhR激活的标志物CYP1A1的mRNA表达，同时诱导抗氧化酶NAD(P)H:醌氧化还原酶的mRNA表达，还能抑制Th2细胞因子白介素（IL）-4的产生。在AD样皮炎小鼠中，外用Tapinarof可促进皮肤中Cyp1a1和Nqo1的表达，抑制IL-4的产生、耳部肿胀及组织病理学改变，同时还能抑制作为皮肤屏障功能指标的经皮水分流失升高。这些结果表明，Tapinarof可抑制AD样皮肤炎症，其作用可能涉及抗氧化、抑制Th2细胞因子产生以及改善皮肤屏障功能等多种药理作用。

实验材料与仪器

材料

Tapinarof、FK506一水合物、乙醇、二甲基亚砜、2,4-二硝基氟苯

冷冻保存的人外周血单个核细胞。

动物：6周龄雌性BALB/c小鼠。

试剂盒与试剂

RPMI-1640培养基、10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素G、100 μg/mL链霉素、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28、佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯、植物血凝素-L、RNeasy Mini Kit、Human IL-4 Quantikine HS ELISA试剂盒、Mouse IL-4 Quantikine ELISA试剂盒、CellTiter-Glo 2.0 Assay、TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit、Taqman探针、10%中性缓冲福尔马林。

仪器

96孔细胞培养板、数字测厚仪、ASCH VAPOSCAN 经皮水分流失测量仪、QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统、光学显微镜、组织包埋机、石蜡切片机。

ASCH VAPOSCAN 经皮水分流失测量仪

实验过程

本研究分为体外人PBMCs实验、体内DNFB诱导小鼠AD样皮炎实验，同时开展组织病理检查与统计学分析，所有动物实验均遵循ARRIVE指南及日本烟草公司制药研究所动物实验指南。

体外人PBMCs实验

1. AhR通路激活与抗氧化基因表达检测：将解冻后的人PBMCs接种于96孔板，加入CD3/CD28抗体刺激2天，随后加入0.01、0.1、1 μmol/L的Tapinarof继续培养1天；收集细胞并提取总RNA，通过RT-qPCR检测CYP1A1和NQO1的mRNA表达水平。

2. Th2细胞活化抑制检测：将人PBMCs以相同方式接种，加入PMA和PHA-L刺激，同时加入0.1、0.3、1、3、10 μmol/L的Tapinarof培养2天；收集细胞上清液，通过ELISA检测IL-4含量，并用CellTiter-Glo 2.0 Assay检测细胞活力。

体内DNFB诱导小鼠AD样皮炎实验

1. 模型构建与给药：将适应饲养1周后的7周龄雌性BALB/c小鼠左侧耳部双侧，用0.15% DNFB（丙酮/橄榄油3:1溶解）25 μL进行处理，每3-4天1次，共5次，持续15天；从DNFB处理当天开始，每日给小鼠左侧耳部双侧外用20 μL的Tapinarof（0.01%、0.1%、1%）、FK506（0.1%）或乙醇载体，持续15天。

2. 指标检测：在第1、2、8、9、15、16天用数字测厚仪检测小鼠耳厚度，计算与基线的差值；第16天检测耳厚度后，用ASCH VAPOSCAN 经皮水分流失测量仪测皮肤TEWL；随后处死小鼠，取左侧耳部组织分为三部分，分别用于基因表达、细胞因子检测和组织病理检查。

第16天测量的耳部皮肤 TEWL

3. 基因与细胞因子检测：将耳部组织匀浆后提取总RNA，通过RT-qPCR检测Cyp1a1和Nqo1的mRNA表达；通过ELISA检测耳部组织中的IL-4水平。

4. 组织病理检查：将耳部组织用10%中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋、HE染色，在光学显微镜下观察真皮炎症细胞浸润、表皮角化过度、痂皮形成情况，并按既定标准进行病理分级。

统计分析

体外实验采用Shirley-Williams检验比较载体组与Tapinarof组的差异，单侧水平2.5%；体内实验先通过F检验/巴特利特检验进行方差齐性分析，方差齐时采用Student t检验/邓尼特检验，方差不齐时采用Aspin-Welch t检验/Steel检验，双侧水平5%。

实验结论

1. Tapinarof可在人PBMCs中激活AhR通路并抑制Th2细胞活化：在0.01 μmol/L及以上浓度时，Tapinarof可上调人PBMCs中CYP1A1和NQO1的mRNA表达，激活AhR通路与抗氧化活性；在0.1~10 μmol/L浓度范围内，Tapinarof可浓度依赖性抑制PMA/PHA-L刺激的人PBMCs产生IL-4，仅10 μmol/L时出现细胞活力明显下降，证明其可有效抑制Th2细胞活化。

2. Tapinarof可抑制小鼠AD样皮肤炎症：DNFB诱导的小鼠出现明显耳部肿胀，而0.01%及以上浓度的Tapinarof可抑制小鼠耳肿胀，效果与阳性药FK506相当；同时Tapinarof可降低小鼠皮肤TEWL，改善表皮屏障功能。

3. Tapinarof可减轻AD样皮炎小鼠的组织病理损伤：载体组小鼠真皮出现重度炎症细胞浸润，表皮存在轻至中度角化过度和痂皮形成，而Tapinarof可剂量依赖性降低炎症细胞浸润、角化过度和痂皮形成的发生率与严重程度。

4. Tapinarof可在小鼠皮肤中激活AhR通路并降低IL-4水平：0.01%及以上浓度的Tapinarof可上调小鼠耳部组织中Cyp1a1和Nqo1的mRNA表达，同时抑制DNFB诱导的IL-4水平升高，证明其通过激活AhR通路抑制Th2细胞因子产生，发挥抗炎作用。

5. Tapinarof的抗AD作用涉及多靶点药理机制：Tapinarof不仅可通过激活AhR通路发挥抗氧化作用、改善皮肤屏障功能，还能抑制Th2型炎症反应，其药理特性与现有AD治疗药物不同，是有潜力的新型外用治疗候选药物，或对现有药物无应答/应答不佳的AD患者有效。

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