VAPOSCAN经皮水分流失测量仪探究透明质酸对UVB诱导光老化小鼠皮肤屏障作用

2025年9月，佐贺大学海洋能源研究所化妆品科学实验室Yoshihiro Tokudome研究团队在期刊《Applied Sciences》发表了题为《Orally Delivered Hyaluronic Acid Tetrasaccharide Improves Skin Barrier Function in UVB-Irradiated Mice: A Bioactive

Approach for Cosmetic and Nutritional Applications》的文章，其研究内容为通过Caco-2细胞单层膜通透性测定评估透明质酸四糖（HA4）的肠道吸收情况，并与高分子量透明质酸（HA）进行对比；通过给UVB照射的小鼠口服HA4或HA，检测经表皮水分流失（TEWL）、角质层含水量（SC）和表皮厚度等指标，探究口服HA4对UVB诱导的皮肤屏障损伤的保护作用。

摘要

透明质酸（HA）存在于多种食物中，关于其缓解皮肤干燥的功效已有诸多研究。本研究通过Caco-2细胞单层膜通透性测定，比较了透明质酸四糖（HA4）与高分子量透明质酸的肠道吸收情况，并评估了口服这两种物质后对UVB照射小鼠皮肤的保护作用。结果显示，HA4能透过Caco-2细胞单层膜，120分钟后渗透率达2.67 μg/cm²，而高分子量HA未表现出通透性。给UVB照射的小鼠口服HA或HA4后，于第26天检测发现，对照组的经表皮水分流失（TEWL）较正常组增加17.5±3.1 g/m²/h，而HA4组仅增加8.0±1.7 g/m²/h（与对照组无明显差异）；对照组的角质层含水量下降25.7±1.5任意单位（a.u.），HA4组的下降幅度被抑制，仅为17.5±0.7 a.u.（与对照组相比p<0.05）。第28天检测显示，对照组的表皮厚度达69.5±10.8 μm，HA4组降低至43.5±5.1 μm（与对照组相比p<0.01）。这些研究结果表明，口服HA4能被高效吸收，并减轻UVB诱导的皮肤屏障损伤，提示其有望作为改善皮肤干燥的功能性食品成分。

实验材料与仪器

实验材料

透明质酸四糖、高分子量透明质酸、细胞培养相关试剂：杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、汉克平衡盐溶液（HBSS）、非必需氨基酸、胎牛血清（FBS）等、化学试剂：乙酸钠、乙酸铵、乙酸、甲醇、苏木精-伊红（HE）染色液、氯仿、乙醇、二甲基甲酰胺、己烷、二甲苯、胆固醇、棕榈酸、磷酸、五水硫酸铜、10%福尔马林溶液等、透明质酸酶、实验动物：7-8周龄雄性无毛小鼠（HR-1）

实验仪器

色谱柱、角质层含水量测定仪、ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪、动物实验麻醉装置、冷冻切片机、荧光显微镜

实验过程

1. 细胞培养：将人结肠癌细胞Caco-2以2×10⁵个/皿的密度接种于100 mm培养皿，使用含20% FBS和0.1 mM非必需氨基酸的MEM培养基，在37℃、5% CO₂条件下培养；随后以6.0×10⁴个/cm²的密度接种于Millicell®细胞培养插入物的顶侧，培养28天制备Caco-2细胞单层膜，每两天更换一次培养基。

2. 细胞通透性测试：选用55-60代的Caco-2细胞单层膜，通过Millicell® ERS-2伏安计测定跨上皮电阻（TEER），选取TEER值高于250 Ω·cm²的单层膜进行实验；用HBSS（pH6.0）冲洗单层膜后，在基底侧加入HBSS，顶侧加入5 mg/mL的HA或HA4溶液（HBSS pH6.0配制）；分别在30、60、90、120分钟时从基底侧取样200 μL，并补充等量新鲜HBSS，实验前后均检测TEER值以确认单层膜完整性。

3. HA和HA4的定量测定：用透明质酸酶（40 U/mL，乙酸钠缓冲液pH5.0配制）在37℃下将透过单层膜的HA分解为HA4，持续24小时；采用LC-MS/MS系统定量测定HA4，色谱柱为InertSustain® C18，流动相为含20%甲醇的10 mM乙酸铵溶液，流速200 μL/min，以负离子模式检测（产物/前体离子对192.9/775.2）；通过分解不同浓度HA溶液制备校准曲线。

4. 动物实验：实验小鼠自由摄食饮水，饲养环境为12小时光暗循环、恒温（25±2℃）、恒湿（50±10%）；将0.1 mg/mL的HA和HA4水溶液以10 mL/kg的剂量每日给小鼠口服，持续28天，对照组口服等量纯净水；第1-4周的照射剂量分别为30、60、90、120 mJ/cm²/天，每周3次；每周5次使用ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪检测小鼠的TEWL数据。

ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪

HA4 口服给药联合中波紫外线照射后小鼠的经表皮失水量变化

5. 组织学分析：将皮肤组织包埋于OCT复合物，使用LEICA CM3050S冷冻切片机制备5 μm厚的冷冻切片（内部温度和底座温度均为-25℃）；经10%福尔马林固定、HE染色后，用BZ-710倒置荧光显微镜观察，每个组织切片选取20个点测量表皮厚度并取平均值。

6. 统计分析：采用JMP® v.13.1软件进行统计分析，通过Tukey事后多重比较检验计算p值。

实验结论

1. 肠道吸收方面：HA4能以完整形式透过Caco-2细胞单层膜，120分钟后渗透率达2.67 μg/cm²，而高分子量HA无法透过该单层膜，提示HA4的肠道吸收效率高于高分子量HA。

2. 皮肤屏障保护方面：口服HA4能减轻UVB照射引起的小鼠角质层含水量下降，抑制经表皮水分流失的增加，且效果优于高分子量HA；同时能有效抑制UVB诱导的表皮增厚，改善皮肤形态异常。

应用前景：HA4口服后可高效吸收并发挥皮肤保护作用，有望作为功能性食品成分，用于改善皮肤干燥和皱纹问题，为化妆品和营养领域提供新的生物活性方案。

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