VAPOSCAN经皮水分流失测量仪助力雪腐镰刀菌加剧小鼠特应性皮炎的研究

2024年4月麻布大学的Tomoki Fukuyama研究团队在《Archives of Toxicology》（IF=6.9）期刊上发表了一篇题为“Sub-acute oral exposure to lowest observed adverse effect level of nivalenol exacerbates atopic dermatitis in mice via direct activation of mitogen-activated protein kinase signal in antigen-presenting cells"的文献。研究聚焦于B型单端孢霉烯族真菌毒素——雪腐镰刀菌烯醇的免疫毒性，通过体外细胞实验和小鼠体内实验，探究了亚急性经口暴露于观察有害作用水平的NIV对特应性皮炎的影响及分子机制，明确了NIV通过直接激活抗原呈递细胞中的丝裂原活化蛋白激酶信号通路加剧小鼠特应性皮炎的作用机制。

摘要

本研究利用抗原呈递细胞和特应性皮炎小鼠模型，探究了真菌毒素雪腐镰刀菌烯醇的免疫毒性作用。体外实验采用小鼠巨噬细胞系和小鼠树突状细胞系，将细胞暴露于0.19-5 µmol/L的NIV中24小时后，对促炎细胞因子的产生量进行定量分析。为进一步探究炎症细胞因子的产生通路，通过MAPK抑制剂和磷酸化分析，研究了ERK1/2、p-38和JNK等丝裂原活化蛋白激酶通路在NIV暴露中的可能作用。此外，在半抗原诱导的AD模型中，评估了低浓度NIV经口暴露的促炎效应。

体外实验结果显示，NIV暴露增强了TNFα的产生，且直接诱导了MAPK的磷酸化——MAPK抑制剂预处理后TNFα产生受到抑制，证实了这一通路的参与。与溶剂对照组相比，NIV经口暴露加剧了AD症状，包括耳淋巴结中辅助性T细胞和产生IgE的B细胞数量明显增加，以及IL-4、IL-5和IL-13等促炎细胞因子的分泌增强。研究结果表明，NIV暴露直接增强了ERK1/2、p-38和JNK的磷酸化，导致抗原呈递细胞中TNFα产生增加，这与特应性皮炎的发生发展密切相关。

实验材料与仪器

材料

雪腐镰刀菌烯醇、二甲基亚砜、丙酮、培养基、青霉素-链霉素、混合液、抗磷酸化ERK、抗ERK、抗磷酸化p-38、抗p-38、抗磷酸化JNK、抑制剂、马铃薯葡萄糖琼脂、灭菌大麦培养基、10%福尔马林溶液、苏木精-伊红染色液、革兰氏染色液等。

细胞系：小鼠树突状细胞系、小鼠巨噬细胞系。

实验动物：7周龄雌性NC/Nga小鼠。

实验仪器

96孔/12孔培养板、细胞培养箱、酶标仪、实时荧光定量PCR系统、SDS-PAGE电泳装置、转印系统、蛋白成像系统、流式细胞仪、ASCH VAPOSCAN 经皮水分流失测量仪、细胞计数系统、珠磨式均质器、石蜡包埋机、切片机。

ASCH VAPOSCAN 经皮水分流失测量仪

实验过程

体外细胞实验

1. 细胞培养与NIV暴露：DC2.4细胞接种于含10% FCS和青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基，RAW264.7细胞接种于含相同添加剂的DMEM培养基，均在适宜条件下培养至70%汇合度。将两种细胞（1×10⁵细胞/100 μL）接种到96孔或12孔板，分别暴露于0.19-5 µmol/L的NIV中，培养2、4或24小时，提前进行细胞毒性试验确认无细胞毒性。

2. 炎症细胞因子检测：培养24小时后，收集细胞上清液，采用ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6和TNFα的分泌水平，通过酶标仪测定吸光度值。

3. 促炎细胞因子基因表达分析：采用NucleoSpin® RNA试剂盒提取细胞总RNA（500 ng），经PrimeScript™ RT Master Mix逆转录为cDNA，以β-肌动蛋白为内参基因，通过实时荧光定量PCR检测IL-1β、IL-6和TNFα的基因表达水平（采用2⁻ΔΔCt法计算）。

4. MAPK磷酸化检测：NIV暴露2小时后，采用M-PER™试剂提取细胞总蛋白（10-30 µg），经SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜，加入一抗（抗磷酸化ERK、p-38、JNK等）和二抗孵育，通过ImmunoStar® Zeta试剂显色，利用蛋白成像系统检测并定量磷酸化蛋白水平。

5. MAPK抑制剂实验：在NIV暴露前1小时，向细胞中加入1 µmol/L的ERK1/2、p38或JNK抑制剂预处理，培养24小时后通过ELISA检测TNFα的产生量，验证MAPK通路的作用。

体内动物实验

1. AD小鼠模型建立与NIV暴露：实验第1周，将5% TDI的丙酮溶液局部涂抹于脱毛的小鼠背部皮肤和耳廓进行致敏；随后4周内，每周局部涂抹0.5% TDI进行激发。同时，通过饮用水每日给予小鼠1 ppm、5 ppm NIV（为验证重现性和中间浓度效应，额外设置2.5 ppm NIV组）。

2. 皮肤相关指标监测：实验期间每周检测一次经皮水分流失（TEWL）、耳和背部皮肤厚度，采用0-4分制评估AD症状（0分为无症状，4分为极严重症状）。

经表皮水分流失（TEWL）

3. 样本收集：致敏4周后，收集小鼠背部皮肤、耳淋巴结（LN）和血清样本。

4. 免疫细胞分析：制备耳淋巴结单细胞悬液，经小鼠Fc封闭剂处理后，加入特异性单克隆抗体孵育，通过流式细胞仪分析CD11c⁺CD40⁺树突状细胞、CD3⁺CD4⁺辅助性T细胞、CD19⁺IgE⁺ B细胞等免疫细胞数量。

5. 细胞因子与IgE检测：将淋巴结单细胞悬液（5×10⁵细胞/孔）与Dynabeads小鼠T细胞激活剂CD3/CD28共孵育24或96小时，通过ELISA检测上清液中IL-4、IL-5和IL-13的水平；采用ELISA试剂盒测定血清总IgE水平。

6. 组织病理学评估：将皮肤样本固定于10%福尔马林溶液，石蜡包埋后切成5 μm切片，进行苏木精-伊红染色或革兰氏染色，采用盲法按0-3分制（0为正常，3为严重）评估表皮增生、结痂、细胞浸润、溃疡等病理变化。

7. 皮肤组织RNA分析：采用珠磨式均质器破碎冷冻皮肤组织，提取总RNA并逆转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR检测IL-4、IL-5和IL-13的基因表达水平（以β-肌动蛋白为内参）。

统计分析

所有数据以平均值±标准误表示，多组间比较采用方差分析后进行Dunnett多重比较检验，两组间比较采用非配对t检验，以p<0.05和p<0.01为差异具有统计学意义，使用GraphPad Prism 10软件进行数据分析。

实验结论

1. 体外实验中，NIV暴露对DC2.4细胞的IL-1β和IL-6产生无明显影响，但增强了DC2.4和RAW264.7细胞中TNFα的产生及基因表达；5 μmol/L NIV可增强RAW264.7细胞的IL-1β产生，但对其IL-6的产生和基因表达无影响。

2. NIV暴露以剂量依赖方式诱导DC2.4细胞中ERK1/2、p-38和JNK的磷酸化，且特异性MAPK抑制剂可抑制NIV诱导的TNFα产生，证实NIV通过激活MAPK通路促进促炎细胞因子分泌。

3. 体内实验中，5 ppm NIV经口暴露增加了AD模型小鼠耳淋巴结中2型常规树突状细胞数量，辅助性T细胞和IgE阳性B细胞数量呈增加趋势；同时增强IL-4、IL-5和IL-13等Th2相关促炎细胞因子的分泌，但对血清总IgE水平无明显影响；2.5 ppm NIV组也呈现类似的树突状细胞增殖和细胞因子释放增强效应。

4. 5 ppm NIV暴露加剧了小鼠AD症状，增加皮肤厚度和经皮水分流失，皮肤组织病理学显示表皮结痂、非角化层增生和溃疡症状加重；2.5 ppm NIV暴露可增加经皮水分流失，但对耳皮肤厚度无明显影响；NIV暴露对皮肤组织中IL-4、IL-5和IL-13的基因表达无明显影响。

5. 核心结论：NIV暴露通过直接激活抗原呈递细胞中的ERK1/2、p-38和JNK MAPK信号通路，促进TNFα产生，进而增强局部免疫炎症反应，最终加剧特应性皮炎症状，提示NIV可能是特应性皮炎发生发展的潜在风险因子。

返回列表