VAPOSCAN经皮水分流失测量仪在他莫昔芬诱导Elovl1基因敲除小鼠模型上的应用

摘要

神经酰胺，尤其是酰基神经酰胺和蛋白结合神经酰胺，对皮肤屏障的形成至关重要。然而，由于参与这些神经酰胺生成的基因敲除会导致小鼠新生致死，其在成年小鼠中的敲除效应一直不明确。

2025年5月，北海道大学药学部生物化学实验室的木原章雄研究团队在《Molecular Biology of the Cell》期刊上发表了题为“Relationship between time-dependent epidermal ceramide composition changes and skin barrier function in adult mice"的研究论文。该研究针对酰基神经酰胺和蛋白结合神经酰胺相关基因敲除导致新生小鼠致死，其在成年小鼠中的作用尚不明确的问题，通过构建他莫昔芬诱导的脂肪酸延长酶Elovl1条件性敲除小鼠模型，探究了成年小鼠表皮中神经酰胺组成的时间依赖性变化与皮肤屏障功能的关联，同时揭示了皮肤屏障功能受损后的代偿反应机制。

实验材料与仪器

材料

实验动物：3月龄小鼠。

他莫昔芬、玉米油、dispase分散酶、蛋白K、甲苯胺蓝O、染色试剂、氘标记神经酰胺标准品、氯仿、甲醇、乙酸、异丙醇、75%乙醇、RNAlater、TRIzol Reagent、DNA纯化试剂盒、NucleoSpin RNA II Kit、PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、KOD FX DNA polymerase。

仪器

Veriti 96-Well Thermal cycler PCR仪、Amersham Imager 600凝胶成像仪、实时荧光定量PCR仪、Illumina NovaSeq 6000测序仪、ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪、显微镜、组织破碎仪、离心机、Xevo TQ-XS液相色谱-串联质谱仪。

 ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪

实验过程

1. 小鼠构建与处理：通过Cre-ERT2小鼠系与Elovl1 flox小鼠系杂交获得Elovl1 cKO小鼠和对照小鼠，均饲养在特定无病原体环境中（室温23±1°C、湿度50±10%、12小时光照-黑暗周期），自由摄食饮水。对3月龄Elovl1 cKO小鼠进行腹腔注射他莫昔芬，间隔1天，共5次，诱导Elovl1基因敲除。

2. 基因组PCR检测：在他莫昔芬给药后0、5、10、15、30天，采集小鼠背部剃毛皮肤，经dispase 4°C孵育24小时分离表皮和真皮；取3.0mg干燥表皮，用裂解缓冲液和蛋白K处理后提取基因组DNA，通过PCR扩增Elovl1相关片段，经琼脂糖凝胶电泳检测并定量，验证基因敲除效率。

3. 皮肤屏障功能检测：

TEWL测量：在他莫昔芬给药后0、5、10、15、20、25、30天，小鼠经异氟醚麻醉、剃毛后，使用ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪在背部测量，每只小鼠测量2次取平均值。

甲苯胺蓝染色：给药30天后，颈椎脱臼处死小鼠，剃毛后经甲醇处理、PBS洗涤，用0.1%甲苯胺蓝O溶液4°C染色24小时；冲洗后将皮肤切成1cm²小块，经水孵育后测量630nm处吸光度，定量透皮的甲苯胺蓝量。

4. 表皮形态观察：在他莫昔芬给药后0、10、30天，采集小鼠背部皮肤，制作切片并进行染色，显微镜下观察表皮形态，测量基底层至颗粒层的厚度，记录脂质片层和角质透明颗粒的变化。

5. 神经酰胺组成检测：在他莫昔芬给药后0、5、10、15、30天，分离小鼠表皮，加入氯仿/甲醇混合液和锆珠，经组织破碎仪处理后提取脂质；通过LC-MS/MS分析神经酰胺的种类和数量，利用氘标记标准品进行定量，计算脂肪酸链加权平均长度。

6. 基因表达检测：

RNA测序：给药30天后采集小鼠背部皮肤，经破碎、TRIzol提取总RNA并纯化；构建测序文库后在Illumina NovaSeq 6000上进行150bp双端测序，经质量控制、修剪和比对后，计算转录本每百万读数值。

实时定量RT-PCR：将纯化的总RNA反转录为cDNA，使用特异性引物和KOD SYBR qPCR Mix，在实时荧光定量PCR仪上检测目标基因的mRNA表达水平，以Hprt1为内参基因进行标准化。

7. 统计分析：数据以平均值±标准差表示，采用Welch氏t检验、Dunnett检验和Tukey检验进行统计分析，p<0.05为差异具有统计学意义，通过SPSS进行异常值检验。

实验结论

1. 酰基神经酰胺和蛋白结合神经酰胺对维持成年小鼠皮肤屏障功能至关重要，尽管其并非成年小鼠生存所必需；而相关基因敲除导致的这两种神经酰胺缺乏在新生小鼠中会引发致死性皮肤屏障缺陷。

2. Elovl1基因敲除后，成年小鼠表皮神经酰胺呈现时间依赖性变化：酰基神经酰胺从第5天开始下降，蛋白结合神经酰胺从第10天开始减少，总神经酰胺从第15天开始降低，NS神经酰胺的减少最晚，而NP神经酰胺从第15天开始增加。

3. Elovl1基因敲除导致非酰基游离神经酰胺的脂肪酸链缩短，且不同类别神经酰胺受影响的物种和变化时程存在差异；同时引发表皮形态改变，第10天即出现脂质片层形成受损和表皮增厚，第15天出现部分脱毛和毛发褐变。

4. 皮肤屏障功能受损与神经酰胺变化相关：第15天起TEWL明显升高，且与酰基神经酰胺和蛋白结合神经酰胺均降至对照组约30%的时间点一致；耳朵部位因皮脂腺数量少、皮脂分泌不足，皮肤屏障功能本身弱于背部和腹部。

5. 皮肤屏障功能降低后会启动代偿反应：包括Elovl3、Degs2等与脂质代谢相关基因表达上调，NP神经酰胺含量增加，以及角质形成细胞增殖和分化相关基因表达改变等。

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