VAPOSCAN经皮水分流失测量仪在蔷薇果提取物对角质细胞功能调控研究中的应用

2025年1月23日，神户学院大学的Ken-ichi Mizutani研究团队在期刊《Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry》上发表了一篇题为“Rosae multiflorae fructus extracts regulate the differentiation and vascular endothelial cell-mediated proliferation of keratinocytes"的论文。研究聚焦野蔷薇果提取物对角质形成细胞的调控作用，深入探究其对表皮分化、屏障功能、血管内皮细胞介导的增殖及伤口愈合的影响，同时鉴定了发挥作用的关键活性成分及相关分子机制。

摘要

角质形成细胞是表皮的主要组成成分，维持其增殖与分化的精确平衡对于保护表皮结构和功能至关重要。野蔷薇果提取物在化妆品行业应用广泛，但其一角质形成细胞有益作用的分子机制尚未明确。本研究发现，RMFE可促进体外培养的人正常表皮角质形成细胞和三维表皮模型的表皮分化，增强其屏障功能。此外，RMFE能促进人脐静脉内皮细胞的增殖和血管生成，而经RMFE处理的HUVEC条件培养基可进一步促进NHEK增殖并提升其伤口愈合能力。成分活性分析表明，槲皮素衍生物可能是介导NHEK和HUVEC对RMFE产生应答的关键物质。综上，这些结果提示RMFE通过直接作用于角质形成细胞和内皮细胞介导的间接作用，共同增强表皮功能。

实验材料与仪器

材料

1. 野蔷薇果提取物、化学化合物（异槲皮苷IQ、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷Q3GA、槲皮素3-O-β-D-半乳糖苷Q3Gal、鞣花酸EA、鞣花酸4-O-β-D-木糖苷EADX、鞣花酸4-O-α-L-阿拉伯呋喃糖苷EALA、仙鹤草素AM等）、钙离子检测试剂盒、细胞增殖检测试剂盒、细胞毒性检测试剂、凋亡与死细胞检测试剂盒、BrdU、Mitomycin C。

2. 细胞系：人正常表皮角质形成细胞、人脐静脉内皮细胞、人正常真皮成纤维细胞

3. 培养基及添加物：KGM-Gold培养基及添加因子试剂盒、EGM-2培养基及添加因子试剂盒、FGM-2培养基及添加因子试剂盒。

4. 细胞模型：三维皮肤表皮培养模型

5. 抗体：抗TJP1一抗、抗LOR一抗、抗OCLN一抗、抗CLDN1一抗、Alexa Fluor 488标记驴抗兔IgG二抗、Alexa Fluor 594标记驴抗小鼠IgG二抗、抗BrdU单克隆抗体。

6. 其他：Matrigel、硅胶柱、DAPI染色液。

仪器

CO₂培养箱、离心机、滤膜、酶标仪、细胞分析仪、实时荧光定量PCR仪、共聚焦显微镜、跨上皮电阻仪、ASCH VAPOSCAN 经皮水分流失测量仪、相差显微镜、全功能荧光显微镜、液相色谱-飞行时间质谱仪、热板、ImageJ图像分析软件、Adobe Photoshop图像处理软件、Microsoft Excel。

ASCH VAPOSCAN 经皮水分流失测量仪

实验过程

1. 试剂制备与细胞培养：RMFE冻干粉溶解于实验缓冲液或培养基中，使用多个批号提取物验证效果一致性；NHEK、HUVEC、NHDF分别在对应培养基中于37℃、5%CO₂条件下培养，培养基每2天更换一次，NHEK采用3名供体混合样本以避免个体差异。

2. 条件培养基制备：P4代HUVEC或NHDF培养至50%-60%汇合度，经RMFE处理24小时后更换为KGM-Gold培养基继续培养24小时，收集培养基，离心去除细胞碎片并过滤，制备内皮细胞条件培养基或成纤维细胞条件培养基，以无细胞培养的KGM-Gold培养基为对照。

3. 三维皮肤表皮模型培养：将RMFE应用于LabCyte EPI-MODEL24 6D模型的角质层侧，在37℃、5%CO₂条件下培养2或7天，每日更换含或不含RMFE的培养基。

4. 细胞增殖检测：细胞接种于96孔板培养24小时后，经RMFE或目标化合物处理24小时，采用Cell Counting Kit-8检测，测定450 nm处吸光度值并计算平均吸光度。

5. 细胞毒性与死细胞检测：NHEK接种后经不同浓度RMFE处理，采用WST-1试剂检测细胞毒性，通过Muse Annexin V & Dead Cell Kit结合Guava Muse Cell Analyzer检测凋亡及死细胞比例。

6. RT-qPCR检测：提取细胞总RNA并合成cDNA，采用SYBR Green标记进行定量PCR，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参基因，分析分化标志物、屏障功能相关基因、表皮干细胞标志物及血管生成相关基因的表达水平。

7. 免疫荧光染色与成像：细胞或三维模型经4%多聚甲醛固定、封闭液处理后，加入一抗孵育过夜，再与荧光二抗孵育，DAPI染色细胞核，通过共聚焦显微镜获取图像；采用BrdU掺入法结合免疫荧光染色评估细胞增殖。

8. 屏障功能检测：三维模型经RMFE处理2天后，使用跨上皮电阻仪检测TEER值，计算单位面积电阻；通过ASCH VAPOSCAN 经皮水分流失测量仪检测TEWL值，模型先在37℃热板上放置30分钟后再进行测量。

对照组和0.25 μ RMFE 处理的三维培养人表皮模型的跨表皮水分流失(TEWL)值      

9. 管形成实验：48孔板包被Matrigel并孵育，接种P4代HUVEC并加入含RMFE的培养基，培养6小时后通过相差显微镜获取图像，ImageJ软件分析管长、分支点数量及连接点数量。

10. 划痕实验：NHEK接种形成单层细胞后，用微量移液器吸头划痕，更换为含RMFE、对照ECCM或RMFE-ECCM的培养基，部分组添加Mitomycin C抑制增殖，培养48小时并进行时间序列成像，计算伤口闭合率。

11. LC-TOF/MS分析：采用液相色谱-飞行时间质谱仪分析RMFE成分，鉴定其含有的化学化合物。

12. 统计分析：两组数据采用非配对双侧Student's t检验分析差异，结果以平均值±标准误（SEM）表示，P<0.05、P<0.01、P<0.001分别表示不同水平。

实验结论

1. RMFE可直接促进NHEK和三维表皮模型的表皮分化，上调早期分化标志物（K10、SPRR1B）和晚期分化标志物（兜甲蛋白、LOR）的表达，且K10表达呈剂量依赖性增加；同时上调紧密连接相关基因（OCLN、CLDN1、TJP1）及蛋白表达，增强TEER值并降低TEWL值，提升表皮屏障功能，该作用并非由钙离子介导。

2. RMFE能促进HUVEC增殖和血管生成，RMFE-ECCM可促进NHEK增殖、上调表皮干细胞标志物（K15、DLL1）表达，且提升NHEK伤口愈合能力，该愈合作用依赖细胞增殖而非迁移；而RMFE-DFCM对NHEK无明显影响，表明RMFE的作用更依赖内皮细胞介导。

3. LC-TOF/MS鉴定显示，本研究使用的RMFE为II型（不含多花苷A），包含槲皮素衍生物（IQ、Q3GA、Q3Gal）、鞣花酸及其衍生物（EADX、EALA、AM、EA）等成分。

4. 槲皮素衍生物（尤其是IQ）是RMFE发挥作用的关键活性成分，可直接促进NHEK分化和屏障功能形成，降低TEWL值，同时促进HUVEC增殖并上调血管生成相关基因（内皮粘蛋白、DLL4、Apelin）表达。

5. 综上，RMFE通过直接作用于角质形成细胞和内皮细胞介导的间接作用，双重调控表皮增殖与分化平衡，增强表皮屏障功能并促进伤口愈合，为其在化妆品和医药领域的应用提供了分子机制支持。

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