Omegawave FLO-C1激光多普勒血流仪探究大鼠咬肌血流量变化

该研究由北海道健康科学大学牙口腔生物学系的Takeharu Niioka团队发表在《Archives of Oral Biology》期刊。研究聚焦大鼠咬肌，围绕三个问题展开：（1）支配血管的副交感神经是否具有血管活性肠肽（VIP）免疫反应性；（2）静脉注射VIP是否会诱发血管舒张；（3）在存在或不存在阿托品的情况下，选择性VIP受体拮抗剂[4Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷]VIP对副交感神经血管舒张的影响。

摘要

已知副交感神经血管舒张纤维通过胆碱能和非胆碱能两种机制支配大鼠咬肌的血管，但非胆碱能机制尚不明确。近年来，血管活性肠肽（VIP）已被证实参与口腔颌面部（如下颌下腺和下唇）的副交感神经血管舒张过程，然而关于大鼠咬肌的相关研究却极为有限。本研究以大鼠咬肌为研究对象，旨在评估：（1）支配血管的副交感神经是否具有VIP免疫反应性；（2）静脉注射VIP是否会诱发血管舒张；（3）在存在或不存在阿托品的情况下，选择性VIP受体拮抗剂[4Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷]VIP对副交感神经血管舒张的影响。研究发现，在副交感耳神经节（OG）以及血管周围的神经纤维这两个部位均检测到VIP免疫反应性。静脉注射VIP可诱发血管舒张，而[4Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷]VIP能减弱VIP注射所引发的血管舒张效应。单独使用[4Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷]VIP无法抑制副交感神经血管舒张，但当[4Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷]VIP与阿托品联合使用时，可减弱副交感神经血管舒张。这些结果表明：（1）支配咬肌血管的节后副交感神经中存在VIP；（2）静脉注射VIP可诱发咬肌血管舒张；（3）当毒蕈碱胆碱能受体被阿托品阻断或乙酰胆碱（ACh）释放受到抑制而失活时，VIP可能参与咬肌的副交感神经血管舒张过程。

实验材料与仪器

（一）实验材料

1. 实验动物：成年雄性Wistar大鼠；

2. 示踪剂与试剂：2%荧光金、无菌生理盐水、VIP、选择性VIP受体拮抗剂[4Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷]VIP、阿托品、乌拉坦、潘库溴铵；

3. 抗体与染色相关试剂：VIP抗体、囊泡乙酰胆碱转运体抗体、Alexa-488标记驴抗兔IgG抗体、Alexa-568标记驴抗山羊IgG抗体、荧光素标记蓖麻凝集素I、1%非免疫驴血清、0.3%曲拉通X-100、0.3%牛血清白蛋白、4%多聚甲醛、0.1M磷酸缓冲液、30%蔗糖；

（二）实验仪器

4. Omegawave FLO-C1 激光多普勒血流仪、荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、冷冻切片机、Hamilton微量注射器、加热垫、人工呼吸机、导管（用于股静脉和股动脉插管）

Omegawave FLO-C1激光多普勒血流仪

实验过程

1. 动物饲养与伦理审批

2. 荧光双标记实验

3. 免疫组化染色

4. 咬肌血流量测量：实验前切断双侧颈迷走神经和颈上交感干，以排除迷走神经和交感神经的影响。通过电刺激左侧舌神经中枢切断端诱发咬肌副交感神经反射性血管舒张，用Omegawave FLO-C1 激光多普勒血流仪监测并记录咬肌血流量（MBF）变化。分别静脉注射不同剂量VIP，观察MBF变化；在注射100ng/kg VIP前20分钟，持续输注[4Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷]VIP，观察其对VIP诱发MBF升高的影响。此外，分别在静脉注射阿托品后、持续输注[4Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷]VIP时、以及两者联合使用时，电刺激舌神经，记录MBF变化，结果以用药前对照反应的百分比表示。

Omegawave FLO-C1激光多普勒血流仪

（A） 舌神经（LN）电刺激（对照）及静脉注射血管活性肠肽（VIP，剂量分别为 1、10 和 100 ng/kg）诱发平均血流量（MBF） 增加的典型示例。

（B） 汇总了注射 0（仅生理盐水）、1、10 和 100 ng/kg VIP 后诱发的 MBF 增加情况（n = 4）。数据以LN 电刺激诱发的对照反应的百分比表示。

（C） （C） 在选择性 VIP 受体拮抗剂（[4 - 氯 - D - 苯丙氨酸⁶, 亮氨酸 ¹⁷] 血管活性肠肽，[4Cl-D-Phe⁶, Leu¹⁷] VIP） 存在与缺失时，注射 100 ng/kg VIP 诱发 MBF 增加的典型示例。

（D） （D） [4Cl-D-Phe⁶, Leu¹⁷] VIP 对 100 ng/kg VIP 注射所诱发 MBF 增加的影响，以预处理反应的百分比表示（n = 5）。

5. 统计分析

实验结论

1. 支配大鼠咬肌血管的节后副交感神经中存在VIP免疫反应性，且VIP与VAChT（胆碱能标志物）在耳神经节的FG标记神经元以及咬肌血管周围的神经纤维上存在共定位；

2. 静脉注射VIP以剂量依赖性方式诱发大鼠咬肌血管舒张，且不影响全身动脉血压，选择性VIP受体拮抗剂[4Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷]VIP可抑制VIP诱发的这种血管舒张效应，表明VIP通过激活咬肌血管壁上的VIP受体发挥作用；

3. 单独使用[4Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷]VIP对舌神经刺激诱发的咬肌副交感神经血管舒张无影响，单独使用阿托品可部分减弱该血管舒张效应；而当[4Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷]VIP与阿托品联合使用时，可抑制该血管舒张效应，提示当毒蕈碱受体被阿托品阻断或乙酰胆碱释放受到抑制时，VIP参与咬肌的副交感神经血管舒张调节。

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