GBX eFAst-Lab水分活度仪在调控山梨醇向还原糖转化及水分状态分析中的应用

2024年3月，来自江南大学食品科学与技术国家重点实验室的夏书芹研究团队，在期刊《Food Bioscience》（IF=5.9）上发表了一项研究。该研究探讨了甘油对山梨醇-甘氨酸体系在热处理过程中褐变反应的影响机制，具体研究了甘油浓度与加热时间对该体系褐变程度、无色中间产物积累、荧光物质生成及α-二羰基化合物动态变化的影响，并从水活度和水分状态角度解释了甘油依赖型褐变的原因。

摘要

在山梨醇和氨基酸体系的高温加工和长期储存过程中，观察到了意想不到的褐变现象。本研究探讨了甘油对不同热处理时间下山梨醇-甘氨酸模型体系褐变反应的影响。结果证实，部分山梨醇会转化为葡萄糖和果糖，这些还原糖与甘氨酸发生美拉德反应，生成类黑精。甘油浓度和加热时间与反应进程呈正相关，这反映在褐变指数增加、无色中间产物增加以及荧光物质积累上。与不含甘油的体系相比，当甘油浓度为4 mol/L时，褐变指数增加了约100倍，无色中间产物的积累增加了65倍。此外，体系中α-二羰基化合物（乙二醛、甲基乙二醛和2,3-丁二酮）的含量受到甘油的影响，随着类黑精的积累呈现先增加后减少的趋势，在加热2 h后达到190.6 mg/L的峰值。甘油依赖型褐变与体系始终处于较高水平的水活度（>0.80）以及游离水向固定水的迁移率（0.60%至8.59%）有关。这表明，甘油可通过影响底物浓度、削弱产物的抑制作用以及促进山梨醇向还原糖的转化来推动褐变反应。

实验材料与仪器

实验材料

山梨醇、乙二醛和2,3-丁二酮、甲基乙二醛、甘油、甘氨酸、葡萄糖和果糖、邻苯二胺

实验仪器

紫外-可见分光光度计、荧光光谱仪、高压离子色谱仪、超高效液相色谱仪、GBX eFAst-Lab水分活度仪、脉冲核磁共振分析仪、压力反应瓶、油浴锅

实验过程

1、反应溶液的配制：用去离子水配制含有0.25 mol/L甘氨酸、1.25 mol/L山梨醇和不同浓度甘油（0-4.00 mol/L）的反应溶液，使用HCl溶液（2.00 mol/L）和NaOH溶液（2.00 mol/L）将pH调节至6.80。将溶液转移至压力反应瓶中，在120°C的油浴中分别加热0、1、2、3和4 h。加热结束后，将样品取出并置于冰水中以终止反应。

2、褐变指数与无色中间产物的测定：取反应溶液，使用紫外-可见分光光度计在420 nm波长下测定褐变指数，在294 nm波长下测定无色中间产物含量。由于吸光度超出有效范围，将溶液浓度稀释至原浓度的1/10后在294 nm下进行测定。

3、荧光强度测定：使用荧光光谱仪对反应溶液中的荧光物质强度进行测定，激发波长设为347 nm，发射波长范围设为400-600 nm。

4、还原糖含量的测定：采用高压离子色谱仪（HPIC）测定还原糖（葡萄糖、果糖）含量。使用PA20色谱柱进行梯度洗脱，流动相A为0.1 mol/L乙酸钠溶液，流动相B为250 mmol/L NaOH溶液。色谱条件为：0-13 min保持2% NaOH，13-14 min线性梯度从2% NaOH升至80% NaOH，14-23 min保持80% NaOH。流速10.5 mL/min，进样量10 μL。

5、α-二羰基化合物的测定：采用邻苯二胺（OPD）对α-二羰基化合物（乙二醛GO、甲基乙二醛MGO和2,3-丁二酮）进行衍生化处理，使其转化为喹喔啉结构。使用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用系统（UPLC-TQD）进行定量检测。色谱条件：Agilent LiChrospher C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm, 5 μm），柱温40°C，进样量1 μL，紫外检测波长320 nm，流速1 mL/min。流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱程序为：0-1 min保持0%乙腈，1-10 min线性梯度升至30%乙腈，10-12 min线性梯度升至50%乙腈，12-12.5 min线性梯度升至100%乙腈，12.5-15 min线性梯度降至0%乙腈。质谱采用电喷雾正离子模式（ESI+）检测。标准曲线如下：GO：y = 95.98x + 194.5（R² = 0.9991），MGO：y = 745.18x – 2071.7（R² = 0.9995），2,3-BD：y = 1952.4x – 4303.7（R² = 0.9997）。

6、水活度的测定：使用GBX eFAst-Lab水分活度仪测定样品水活度。测试前，选择水活度为0.84的标准样品对水活度测定仪进行校准。校准完成后，将4 mL样品溶液置于样品盘中，在25°C下进行测定。

GBX eFAst-Lab水分活度仪

7、水分状态分析：使用脉冲核磁共振分析仪（LF-NMR）对水分状态进行分析。将装有5 mL样品的样品瓶放入直径25 mm的核磁管中，通过CPMG RF脉冲序列采集信号。参数设置为：90°脉冲时间7 μs，180°脉冲时间14 μs，重复时间9000 ms，回波次数16000次，回波时间1.3 ms。最后使用核磁共振反演软件（版本2.0）获得横向弛豫时间（T2）曲线。

实验结论

1. 甘油促进褐变反应：随着甘油浓度和加热时间的增加，体系褐变指数和无色中间产物含量均呈上升趋势。当甘油浓度为4 mol/L时，与不含甘油的体系相比，褐变指数增加约100倍，无色中间产物积累增加65倍。这表明甘油能够推动山梨醇-甘氨酸体系的褐变反应进程。

2. 甘油影响α-二羰基化合物动态变化：α-二羰基化合物（乙二醛、甲基乙二醛和2,3-丁二酮）在体系中的含量呈现先增加后减少的趋势，在加热2 h后达到190.6 mg/L的峰值。这表明随着反应进入类黑精积累阶段，α-二羰基化合物的消耗速率大于生成速率。

含不同浓度甘油的山梨醇-甘油醛体系在不同时间热处理后水活度的变化

3. 甘油通过水分状态调控反应：体系水活度始终保持在较高水平（>0.80）。随着甘油浓度升高，游离水比例降低（从加热4 h后的99.43%降至91.41%），固定水比例增加。游离水减少有利于山梨醇的脱水分解，促进还原糖的生成，从而推动美拉德反应。

4. 反应机制：部分山梨醇转化为葡萄糖和果糖，暴露出羰基，与甘氨酸发生美拉德反应生成类黑精。甘油通过影响底物浓度、削弱产物抑制作用以及促进山梨醇向还原糖的转化来增强褐变反应。

参考文献

1.Martins, S., & van Boekel, M. (2005). A kinetic model for the glucose/glycine Maillard reaction pathways. Food Chemistry, 90(1-2), 257-269. 

2.Smarrito-Menozzi, C., Matthey-Doret, W., Devaud-Gounoens, S., & Viton, F. (2013). Glycerol, an underestimated flavor precursor in the Maillard reaction. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61(43), 10225-10230. 

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