基于经皮水分流失测量仪评估雪腐镰刀菌烯醇对AD小鼠皮肤屏障功能的影响

2024年4月，Tomoki Fukuyama团队在《Archives of Toxicology》（IF=6.9）期刊上发表了题为“Subacute oral exposure to lowest observed adverse effect level of nivalenol exacerbates atopic dermatitis in mice via direct activation of mitogenactivated protein kinase signal in antigenpresenting cells"的研究论文。该研究探讨了霉菌毒素雪腐镰刀菌烯醇（Nivalenol,NIV）的免疫毒性作用，重点关注其对抗原呈递细胞的影响及其在特应性皮炎（AD）小鼠模型中的作用。

摘要

本研究使用抗原呈递细胞和特应性皮炎（AD）小鼠模型，调查了霉菌毒素雪腐镰刀菌烯醇（NIV）的免疫毒性作用。体外实验使用小鼠巨噬细胞系（RAW 264.7）和小鼠树突状细胞系（DC 2.4）。细胞暴露于NIV（0.19-5μmol）24小时后，定量检测了促炎细胞因子（IL-1β、IL-6和TNFα）的产生。为研究炎症细胞因子产生通路，使用MAPK抑制剂和磷酸化分析，探究了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路（如ERK1/2、p-38和JNK）在NIV暴露中的可能参与。此外，在半抗原诱导的AD NC/Nga小鼠模型中，评估了低浓度（1或5 ppm）NIV口服暴露的促炎作用。体外实验表明，暴露于NIV会促进TNFα的产生。此外，使用MAPK抑制剂预处理后，TNFα的产生受到抑制，这表明NIV直接诱导了MAPK的磷酸化。与对照组相比，口服NIV暴露加剧了AD症状，包括耳廓淋巴结中辅助T细胞和产生IgE的B细胞数量增加，以及促炎细胞因子（如IL-4、IL-5和IL-13）分泌增多。研究结果表明，暴露于NIV直接增强了ERK1/2、p-38和JNK的磷酸化，导致抗原呈递细胞中TNFα产生增加，这与特应性皮炎的发展密切相关。

材料与仪器

主要材料：

实验动物：雌性NC/Nga小鼠（7周龄）。

实验材料：

雪腐镰刀菌烯醇（NIV）、小鼠树突状细胞系（DC2.4）、小鼠巨噬细胞系（RAW264.7）、TDI、抑制剂、抗体、细胞培养基、胎牛血清、T细胞活化磁珠等。

主要仪器：

酶标仪、实时荧光定量PCR系统、流式细胞仪、Western blot成像系统、ASCH VAPO SCAN经皮水分流失测量仪、细胞计数仪、匀浆仪

实验过程

体外细胞实验：

将DC2.4和RAW264.7细胞与不同浓度的NIV（0.19-5μmol/L）共培养24小时。

收集上清液，通过ELISA检测促炎细胞因子（IL-1β,IL-6,TNFα）的蛋白水平。

提取细胞总RNA，通过qPCR检测相应细胞因子的基因表达水平。

为探究MAPK通路，细胞暴露于NIV 2小时后，通过Western blot检测ERK1/2、p-38和JNK的磷酸化水平。

使用特异性MAPK抑制剂（ERK1/2,p38,JNK抑制剂）预处理细胞1小时，再加入NIV，检测TNFα的产生情况。

体内动物实验：

使用TDI在NC/Nga小鼠上建立AD模型。小鼠背部皮肤和耳廓每周接受TDI涂抹以诱导AD。

同时，通过饮用水给予小鼠不同剂量的NIV（1 ppm或5 ppm），持续4周。

实验期间，每周监测AD评分、耳部和背部皮肤厚度，并用ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪测量经皮水分散失数据（TEWL）。4周后，收集小鼠的背部皮肤、耳廓淋巴结和血清样本。

ASCH VAPOSCAN 经皮水分流失测量仪

口服NIV使TEWL值上升

制备耳廓淋巴结单细胞悬液，使用流式细胞术分析树突状细胞（CD11c+CD40+）、辅助T细胞（CD3+CD4+）和B细胞（CD19+IgE+）的数量变化。

用CD3/CD28抗体磁珠刺激淋巴结细胞，通过ELISA检测上清液中Th2型细胞因子（IL-4,IL-5,IL-13）的释放。

通过ELISA检测血清总IgE水平。

对皮肤样本进行H&E染色，进行组织病理学评估（包括结痂、增生、细胞浸润等）。

通过qPCR检测皮肤组织中IL-4,IL-5,IL-13的基因表达。

实验结论

本研究表明，暴露于NIV能直接刺激抗原呈递细胞的功能。其机制是通过激活MAPK信号通路（ERK1/2,p-38,JNK），促进TNFα的产生。在AD小鼠模型中，口服暴露于接近观察到的不良反应水平（LOAEL）的NIV（5 ppm），会增强局部淋巴结中树突状细胞的增殖和Th2型细胞因子（IL-4,IL-5,IL-13）的分泌，从而加剧AD的临床症状、皮肤增厚和皮肤屏障功能损伤。研究结果提示，NIV可能通过作用于抗原呈递细胞，成为加剧特应性皮炎的潜在环境因素。

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