糖尿病大鼠牙周炎模型如何用Omegawave FLO-N1激光多普勒血流仪测量牙龈

Toru Nishikawa团队发表于《Journal of the International College of Dentistry》的研究通过链脲佐菌素（STZ）诱导建立糖尿病大鼠模型，在该模型中诱导实验性牙周炎，以一氧化氮（NO）通路为重点，探究糖尿病状态下牙周病恶化的机制，重点分析牙龈血流、炎症相关基因（肿瘤坏死因子 -α/TNF-α、诱导型一氧化氮合酶 /iNOS）表达及亚硝基应激标志物（硝基酪氨酸）的变化。

摘要

<目的>为明确糖尿病状态下牙周病恶化的机制，本研究通过链脲佐菌素（STZ）诱导建立糖尿病大鼠模型，在该模型中诱导实验性牙周炎，并以一氧化氮（NO）通路为重点展开探讨。

<材料与方法>对 5 周龄雄性SD大鼠，通过腹腔注射 STZ（60mg/kg）诱导糖尿病。STZ 注射 2 周后，在上颌右侧第二臼齿（M2）的牙颈部结扎尼龙线（3-0 Surgilon）以诱导实验性牙周炎，该侧作为实验侧；另一侧不进行处理，作为对照侧。实验性牙周炎诱导 2 周后，先测量牙龈组织血流，随后处死大鼠，对牙龈组织进行基因表达分析及组织学检查。

<结果>糖尿病大鼠对照侧的牙龈血流显著低于正常大鼠对照侧；无论正常大鼠还是糖尿病大鼠，牙周炎诱导后其牙龈组织血流均较各自对照侧显著增加。基因表达分析显示，正常大鼠中，牙周炎诱导后 TNF-α 基因表达虽有增加趋势，但无统计学差异，而 iNOS 基因表达显著增加；糖尿病大鼠中，牙周炎诱导后 TNF-α 与 iNOS 基因表达均显著增加。组织学检查显示，正常大鼠牙周炎诱导部位仅见轻度炎症细胞浸润，而糖尿病大鼠该部位可见显著炎症细胞浸润。进一步分析牙龈组织中硝基酪氨酸的表达发现，正常大鼠牙周炎诱导部位可见硝基酪氨酸阳性细胞，但糖尿病大鼠在牙周炎诱导后，硝基酪氨酸阳性细胞数量显著增加。

<结论>本研究证实，糖尿病大鼠实验侧牙龈组织中硝基酪氨酸阳性细胞数量显著增加，提示在糖尿病合并牙周病的过程中，亚硝基应激发挥重要作用；同时提示，抑制亚硝基应激可能成为糖尿病相关牙周炎的治疗策略之一。

实验材料与仪器

（一）实验材料

1. 实验动物：5 周龄雄性SD大鼠

2. 糖尿病诱导剂：链脲佐菌素（STZ）；牙周病诱导材料：尼龙缝合线（3-0 Surgilon）；麻醉剂：pentobarbital

（二）实验仪器

1. Omegawave FLO-N1激光多普勒血流仪，用于测量牙龈组织血流

Omegawave FLO-N1激光多普勒血流仪

牙龈组织中的血流值

2. 实时荧光定量 PCR 仪：基因表达定量分析

3. 光学显微镜：用于组织切片染色后的观察与细胞计数

4. 低温储存设备：液氮罐（用于组织快速冷冻）、-80℃冰箱（用于组织长期保存）

5. 加热垫：用于测量牙龈血流时维持大鼠直肠温度在 37℃

实验过程

（一）实验动物饲养与糖尿病模型建立

1. 所有 SD 大鼠饲养于恒温（23±1.0℃）、恒湿（45±10%）的动物室，采用 12 小时明暗交替周期，通过自动供水装置提供自来水。

2. 向大鼠腹腔注射 STZ（60mg/kg）以诱导糖尿病；STZ 注射 1 周后检测大鼠血糖值，将血糖≥200mg/dL 的大鼠判定为糖尿病模型大鼠，纳入后续实验。

（二）实验性牙周炎诱导

STZ 注射 2 周后，对所有大鼠（正常大鼠 + 糖尿病大鼠）进行处理：（0.5mg/kg，腹腔注射）麻醉下，在上颌右侧第二臼齿（M2）牙颈部缠绕尼龙缝合线（3-0 Surgilon），尽量避免损伤牙龈，于近心口盖处打结固定（该侧为实验侧）；上颌左侧第二臼齿不做处理（为对照侧）。

（三）牙龈组织血流测量

1. 牙周炎诱导后，通过腹腔注射（0.5mg/kg）麻醉大鼠，将激光多普勒血流仪（FLO-N1）探头固定于实验侧与对照侧 M2 的颊侧牙龈正上方。

2. 测量过程中，将大鼠置于 25℃加热垫上以维持直肠温度 37℃，记录血流值（单位：ml/min/100g tissue）。

（四）组织采集与处理

1. 实验性牙周炎诱导 2 周后，通过腹腔注射（1.5mg/kg）处死大鼠。

2. 采集实验侧与对照侧 M2 的颊侧牙龈组织：一部分立即放入液氮快速冷冻，随后转移至 - 80℃冰箱保存（用于基因表达分析）；另一部分连同双侧上颌组织取下，放入 10% 福尔马林溶液固定 24 小时（用于组织学分析）。

（五）基因表达分析

1. 用 TRIzol Reagent 从冷冻牙龈组织中提取总 RNA，再以总 RNA 为模板，用 SuperscriptⅢ RNase H-Reverse Transcriptase 合成 cDNA。

2. 采用 TaqMan Universal PCR Master Mix 与 TaqMan 探针，在 ABI Prism 7000 仪器上进行 PCR 反应，反应条件为 95℃ 1 分钟、52℃ 1 分钟、72℃ 30 秒，共 40 个循环。

3. 以 GAPDH 为内参基因，采用 ΔΔCt 法计算 TNF-α 与 iNOS 基因的相对表达量。

实验结论

本研究证实，糖尿病大鼠实验侧牙龈组织中硝基酪氨酸阳性细胞数量显著增加，提示在糖尿病合并牙周病的过程中，亚硝基应激发挥重要作用；同时提示，抑制亚硝基应激可能成为糖尿病相关牙周炎的治疗策略之一。

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