文献分享 | IVPT离体皮肤屏障针头穿刺破坏验证实验中经皮水分流失值变化灵敏度测试研究

引言

Eman Elmahjoubi团队与纽卡斯尔大学合作在《Toxicology in Vitro》发表研究，采用Biox AquaFlux经皮水分流失测量仪，系统验证了经表皮水分流失（TEWL）法评估体外全层猪皮屏障功能的有效性，为皮肤毒性检测与屏障功能评估提供了高效替代方案。

摘要 

皮肤屏障功能是开展体外经皮吸收研究时需考量的关键参数。尽管氚水通量测量常被用于评估皮肤完整性，但近几十年来，更快速、易用的经表皮水分流失（TEWL）法已逐渐兴起。然而，迄今为止，TEWL与体外皮肤屏障功能之间的相关性尚未得到全面明确。本研究采用一款基于冷诱导蒸汽阱原理的新型 TEWL仪器，对全层猪皮的屏障功能进行探测。该方法灵敏度足以体现穿刺对屏障功能的影响，不过观察到的非线性模式提示，可能存在组织肿胀过程和/或毛细作用。多项表面活性剂暴露实验的结果充分表明，TEWL 确实在很大程度上可预测皮肤样品的完整性。核心研究发现为：基础 TEWL 与基础氚水通量呈线性相关）。因此，专用 TEWL 法可作为氚水通量测量的优良替代方案，用于评估全层皮肤屏障功能。

研究背景与目的

1. 皮肤屏障功能评估的重要性：在体外经皮吸收研究中，皮肤样本质量控制至关重要，如 OECD 428 测试指南要求排除受损皮肤样本。传统评估方法（如氚水通量测量）存在局限性，包括无法用于氚标记测试化合物、会水合角质层、耗时且需放射性物质监管审批。

2. 替代方法的争议：近几十年，经皮电阻测量和 TEWL 评估成为氚水通量测量的替代方案。但 TEWL 与体外皮肤屏障功能的相关性尚未明确，不同研究团队因皮肤模型、方法和 TEWL 测量仪器的不同，得出的结果存在冲突。

3. 研究目的：使用新型Biox AquaFlux经皮水分流失测量仪进一步探究 TEWL 与氚水通量的关系，验证 TEWL 方法评估体外全层猪皮肤屏障功能的有效性，具体包括：

◦ 研究基础 TEWL 速率与基础氚水通量的关系；

◦ 考察穿刺针孔数量对经皮水分流失值的影响，判断TEWL 方法能否区分不同穿刺数量；

◦ 研究表面活性剂（尤其是阴离子表面活性剂）对皮肤屏障功能的影响，包括表面活性剂链长、十二烷基硫酸钠（SLS）的浓度、体积和接触时间的作用。

材料与方法

（一）实验材料

1. 化学试剂：氚水（1mCi/ml）、闪烁液、各类阴离子表面活性剂（SLS、辛基硫酸钠（SOS）、癸基硫酸钠（SDS）、十四烷基硫酸钠（STDS）、二十烷基硫酸钠（SES））、磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4）等，均购自特定供应商，实验全程使用双蒸去离子水。

2. 皮肤样本：选用长白猪耳朵，来自当地屠宰场，屠宰后立即采集，不进行蒸汽灭菌。清洗后切成约 8cm² 的完整皮肤样本，无可见缺陷的样本用铝箔包裹，在-80℃下储存不超过 6 个月，使用前室温解冻并切成适合安装在扩散池上的小块。

（二）实验方法

穿刺皮肤样本的 TEWL 测量：用 2.5cm 长的 PrecisionGlide 针头在全层皮肤样本上穿刺，穿刺位置靠近扩散区域中心且贯穿组织全层，穿刺数量分别为 0（对照）、1、2、3、4、5、6、7 个。将穿刺后的皮肤作为屏障膜，接收室含 PBS（pH7.4）的 Franz 池中，皮肤表面保持干燥，插入带专用供给池耦合器的 Aquaflux 测量探头，按上述方法测量 TEWL，每个穿刺实验重复 4 次，穿刺后 10-15 分钟开始 TEWL 测量。

研究数据

皮肤穿刺次数对 TEWL 的影响：单个穿刺使皮肤水分流失量比完整皮肤显著增加约 50%，但 2、3、4 个穿刺孔并未导致 TEWL 进一步显著变化；当穿刺数量为 5 个时，TEWL 出现进一步大幅增加，且在 6、7 个穿刺孔时，TEWL 值维持在该升高水平。各穿刺组（除对照）的 TEWL 值相互间无显著差异，但均与未穿刺皮肤的 TEWL 值有显著差异。

（Biox Aquaflux经皮水分流失测量仪）

结论

本研究体外穿刺数据与其他研究存在差异。Chilcott 等人（2002）用开放室仪器（Evaporimeter）发现穿刺后 1 小时，TEWL 大小与穿刺孔数量成正比；Netzlaff 等人（2006）用 Tewameter 发现仅能区分完整和单孔穿刺的聚四氟乙烯膜，穿刺孔从 1 增加到 5 时 TEWL 不再升高，且穿刺对人表皮膜 TEWL 读数无影响。本研究得到的 “阶梯式" 模式介于两者之间。可能原因包括：接收液可能通过孔被吸到皮肤表面形成水膜；穿刺孔可能因皮肤肿胀而闭合；所用针头尺寸也可能影响实验结果。本研究使用具有隔离微环境的封闭室 TEWL 测量仪器（AquaFlux经皮水分流失测量仪）探测体外全层猪皮肤样本的屏障功能，该方法灵敏度足以检测到穿刺对皮肤屏障功能的降低作用，但观察到的非线性模式需进一步研究以明确其机制。

参考文献：

【1】Aramaki, J., Effendy, I., Happle, R., et al. Which bioengineeringassay is appropriate for irritant patch with sodium lauryl sulphate?Contact Dermatitis 45, 286–290.

【2】Chilcott, R.P., Dalton, C.H., Emmanuel, A.J., et al. Transepidermal water loss does not correlate with skin barrier function in vitro. Journal of Investigative Dermatology 118, 871–875.

【3】Nangia, A., Patil, S., Berner, B., et al. In vitro measurement of transepidermal water loss: a rapid alternative to tritiated water permeation for assessing skin barrier functions. International Journalof Pharmaceutics 170, 33–40.

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